设计更好的IHC/ICC/IF 实验

2019年09月23日

IHC/ICC/IF 实验是用来定位检测抗原表达的免疫检测技术，在科研和临床医学中应用广泛。从技术上讲它们是相对简单和直接的实验方法。然而，涉及到具体实验就会有多个需要优化的变量。

例如，在培养的细胞上检测一种高丰度的蛋白，固定时间和封闭时间可能就需要缩短，并适合使用荧光偶联的一抗检测。相反，如果在一个冰冻组织切片中检测磷酸化表位，可能需要进行抗原的修复，染色信号也需要放大……

这里对七组重要概念加以对比剖析，认识它们的区别和特点将帮助实现更好的实验设计：

 

石蜡切片

 

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冰冻切片

 

? 石蜡切片

 

长期保存最佳选择。石蜡包埋之前必须先固定，可以在组织剥离之后立即用灌流或浸润的方法固定，通常需要 4～24 小时。过度固定会导致抗原被遮蔽起来。如果不能立即包埋，可以将固定后的组织置于乙醇中暂时保存。石蜡是最廉价、使用最普遍的一种组织包埋剂。也可以用树脂包埋组织，这样硬度更高，可以切成更薄的切片（1.5μm vs. 5μm）。

 

 

 

? 冰冻切片

 

好处之一是可省去石蜡包埋之前的固定步骤。对于检测翻译后修饰如磷酸化，速冻具有非常大的优势。将组织浸润在液氮或液态的异戊烷中，或埋在干冰中处理，以得到冰冻组织样品。在冰冻和切片之后可以对样品进行短暂的固定。最常用的固定剂是乙醇，使用乙醇固定可以避免表位被甲醛交联，无需进行抗原修复。在冷冻恒温箱内将冰冻组织切片，切片可以在 -80℃ 保存一年。

 

缺点是：冰冻状态的组织无法长期保存，而且冰晶的形成可能会破坏亚细胞结构。此外，冰冻切片通常比石蜡切片更厚。冰冻组织中的酶仍有活性，封闭可能会影响检测结果的酶的活性就显得尤为重要。

 

 

 

甲醛固定

 

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醇固定

 

? 甲醛固定

 

甲醛是用于保存蛋白最常用的固定剂。一般认为甲醛介导的组织固定取决于蛋白和蛋白或蛋白和核酸之间的亚甲基（-CH2-）交联的形成。甲醛的过度固定会改变抗原表位中的氨基酸并阻止抗体的结合。不过大多数情况下可以使用抗原修复试剂修复抗原表位并恢复和抗体的结合。甲醛会导致磷酸依赖型的表位从膜侧转移到胞质侧。在这种情况下，冰冷的无水甲醇或无水乙醇则是合适的固定剂。

 

? 醇固定

 

细胞和组织固定最常用的醇类是甲醇和乙醇。它们的分子结构和水很接近，能够和水竞争蛋白质中的氢键，替代组织中的水分子。这会减少蛋白质的介电常数，使其在等电点处沉淀，由于蛋白构象的变化，可能会阻止抗体和其表位的结合。醇破坏蛋白质的疏水相互作用并影响到其三级结构，却似乎能够稳定蛋白质的二级结构。

 

通常认为醇对组织形态的保护不如甲醛类固定剂。醇的穿透能力不如甲醛，主要用于固定冰冻组织切片和细胞，更适合于细胞膜表面抗原。醇固定之后不建议进行抗原修复，太剧烈的处理很有可能破坏样本完整性。

 

 

 

组织固定

 

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细胞固定

 

? 组织固定

 

在研究小动物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整组织时，全动物灌流固定往往是保存抗原的最佳方法。对于所感兴趣的组织的固定，可以将剥离出来的组织浸泡在固定剂中。固定液通常是 PBS 配制的 4% 甲醛溶液。

 

为增强固定剂的穿透，组织最好不要超过 10 mm 厚。对于完全固定，固定剂的体积至少是组织体积的 50～100 倍。

 

? 细胞固定

 

与组织样品相比，细胞的固定所需时间更短，可以使用浓度更低的固定剂。例如，用 2% 的甲醛溶液在室温下固定 20 分钟就足以保存细胞形态和抗原性。

 

细胞的固定通常只需要去掉培养基并加入固定剂。对于某些类型的细胞，去除培养基之后表面张力的变化有破坏作用。这时可以在培养基中直接加入固定剂，例如加入等体积的 4% 的甲醛溶液，对细胞进行预固定。两分钟后，换掉预固定培养基，加入新鲜的 2% 的固定剂。

 

 

 

热诱导修复

 

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酶诱导修复

 

抗原修复的需要取决于抗原、抗体、组织类型，固定方法以及持续时间等因素。与比单克隆抗体相比，多克隆抗体能识别多个表位，即使不进行抗原修复，检测到抗原的可能性也很高。

 

? 热诱导的表位修复（HIER）

 

HIER 被认为能逆转一些交联，并实现表位二级或三级结构的重建。实验方案须针对每种组织、固定方法和待研究抗原进行优化。总的来说，HIER 的成功率比 PIER 要高得多。HIER 可利用微波炉、高压锅、蒸屉、高压灭菌锅或水浴开展。在 HIER 实验中，微波炉是越来越流行的设备。这些方案大多加热 5 分钟，然后更换缓冲液。对于所有 HIER 方法，修复完成后必须让玻片冷却。HIER 对时间、温度、缓冲液和 pH 特别敏感，需要根据经验和对比实验确定最佳方法。

 

? 蛋白酶诱导的表位修复（PIER）

 

在 PIER 方法中，蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢复抗体与抗原表位的结合。作用机制是切割了可能遮盖表位的肽段。PIER 的缺点在于成功率低，且可能破坏组织形态和目的抗原。

 

 

 

单克隆一抗

 

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多克隆一抗

 

单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于 IHC/ICC 时的优势和限制。单克隆抗体由单个 B 细胞克隆产生，代表了同质群体，能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用，因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。

 

抗体结合往往依赖于目标蛋白维持其天然的构象状态。与其他蛋白的相互作用、翻译后修饰、温度、pH、固定和盐浓度都会影响抗体接近目的表位。多克隆抗体是异质的，可识别多个表位，因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。一般而言，多克隆抗体在一定 pH 和盐浓度范围内也比单克隆抗体更为稳定。R&D Systems 的多克隆抗体经过抗原亲和纯化, 具有很高的特异性，用于 IHC/ICC/IF 实验的效果优异。

 

 

 

直接检测

 

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间接检测

选择直接检测还是间接检测，这常常取决于抗原的表达水平。例如，高表达抗原的检测可通过与直标一抗来实现。直接检测的优点包括多色染色更为简单，且没有二抗非特异结合的顾虑。主要缺点在于直接检测达不到观察较低表达水平的灵敏度。在极少数情况下，标记过程可能会对一抗的亲和力产生不良影响。

相比之下，间接检测方法通常有着更高水平的灵敏度，并产生更强烈的信号。信号经过间接方法放大，因为至少有两个标记的二抗与每个一抗结合。不过，二抗的使用需要额外的封闭步骤和对照。

利用亲和素和链霉亲和素与生物素的强亲和力，可实现信号的进一步放大。亲和素是一种存在于蛋清中的糖蛋白，按化学计量与生物素结合。链霉亲和素纯化自链霉菌 Streptomyces avidinii，未糖基化，表现出比亲和素更低的非特异结合。两种蛋白的每个分子都结合四个生物素。如果采用生物素化的二抗，那么通过与亲和素-生物素（ABC 方法）或标记的链霉亲和素-生物素（LSAB 方法）的孵育可明显放大信号。链霉亲和素可与检测酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光染料结合。使用这些放大方法需要额外的步骤来防止非特异结合。

 

 

 

荧光检测

 

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显色检测

 

? 荧光检测

 

荧光检测是基于荧光色素的使用，它们在受到较短波长的光激发时发光。荧光色素可直接与一抗或二抗结合，或与链霉亲和素结合。免疫荧光常用于多个细胞目标的同时观察。例如，组织可与不同的一抗混合物孵育，再与结合有荧光色素的二抗孵育，这些荧光染料在不同波长下发光。

多色实验必须经过设计，以限制检测试剂之间的交叉反应性，以及所使用的荧光染料在光谱性质上的交叉。为了限制二抗之间的交叉反应性，一抗应来自不同的物种。这样就能使用物种特异的二抗，分别只识别一个一抗。

 

? 显色检测

 

为了方便显色检测，一抗、二抗或链霉亲和素可与酶结合。在加入可溶的有机底物时，酶与底物反应，产生不溶的有色产物，沉积在抗原表达的位置。常用的酶包括辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP)，它们分别将 3,3'-二氨基联苯胺 (DAB) 和 3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 转化成棕色和红色的终产物。DAB 比 AEC 更常用，因为后者易溶于酒精，且暴露在过度光照下时更容易褪色。在使用 AEC 时必须用水性的复染剂和封片剂。

通常认为显色检测比免疫荧光更为灵敏，但没那么方便，因为孵育和封闭步骤更多。与免疫荧光相似，显色检测也允许多个抗原的观察，但这些抗原只能在细胞和组织的不同位置，因为重叠的颜色可能会使结果难以解释。