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DNA水平检测
（二）DNA甲基化
从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上催化其甲基转移到其他化合物的过程，可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物，DNA碱基上添入甲基基团的化学修饰现象。细菌中的甲基化常发生在腺嘌呤的第6位氨基与胞嘧啶的5位碳原子上。高等生物中的甲基化主要是多核苷酸链的CpG岛上胞嘧啶的5位碳原子，生成m5CpG。DNA的不同甲基化状态(过甲基化与去甲基化)与基因的活性和功能有关。
1. DNA甲基化检测的应用
Ø 遗传性疾病
某些遗传性疾病与基因的甲基化状态改变或甲基化相关基因的异常相关。例如甲基转移酶的变异导致的ICF综合征（immunodeficiency, centromeric instability and facial anomalies）是一种常染色体隐性遗传病, 患者常有各种免疫缺陷和面部畸形的表征, 且在其细胞中心粒周围染色体的稳定性下降。研究DNA甲基化与遗传病的关系可能成为揭示遗传病发病机制的重要方面。
Ø 恶性肿瘤
全基因组的低甲基化和局部性（CpG岛）高甲基化并存这种现象，既是癌症发生的重要原因之一，也是肿瘤良恶转化的重要标志。一般认为，癌症发生的机制主要包括癌基因的活化和抑癌基因的失活，目前研究发现二者都与基因甲基化异常有关。一方面，局部性的高甲基化使抑癌基因表达受到抑制，从而丧失抑癌的功能。另一方面，全基因组的低甲基化可促使癌基因活化、逆转座子的转录活性增强及基因的不稳定性增加。DNA甲基化的检测有望用于肿瘤的早期诊断以及预后的预测，而去甲基化药物在治疗肿瘤的前景更是令人瞩目。
Ø 动植物性状改良
近年来，DNA甲基化作为一种新的分子遗传标记被用于动物遗传育种上，如预测禽畜杂交优势、检测动物生长性质等。在植物研究中，则内容更加广泛。DNA甲基化作为高等植物中普遍存在的一种常见DNA共价修饰方式，参与了植物的许多重要生命过程，控制调节植物基因表达、生长发育、抵御逆境等生命活动。揭示DNA甲基化调控植物基因表达机理，对于改良植物表型性状，提高植物适应性等方面具有重要的作用。
2. 检测方法
Ø 直接测序法
重亚硫酸盐可使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变。经PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序，与未经处理的序列比较，即可判断CpG位点是否发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但过程较为繁琐。见图4。
图4. DNA甲基化测序原理
Ø 甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MS-PCR）
将DNA先用重亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变。随后进行引物特异性的PCR。MS-PCR应按照要求设计两对引物：（1）引物末端均设计至检测位点结束；（2）两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA 链，另一对结合处理后的非甲基化DNA 链。检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能扩增出片段，则说明被检测的位点存在甲基化；若用针对处理后的非甲基化DNA 链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。
图5. MS-PCR原理
MS-PCR的实验流程见图5。MS-PCR的优点是：避免了使用限制性内切酶及其后续的相关问题，敏感性高，可用于石蜡包埋样本。其缺点是：要预先知道待测片段DNA的序列；引物设计至关重要；若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂；MS-PCR只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化。若要求定量，则需用其它方法进一步检测；存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。
Ø 甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation- dependent probe amplification，MS-mlPA)
本方法针对甲基化和非甲基化的位点分别设计两个探针，每个探针都包括两个寡核苷酸部分，其中短的部分由合成产生，长的部分来源于phageM13的衍生物，后者有一个非杂交填充片段，不同探针其长度不同。探针的两个寡核苷酸杂交序列均与目标序列互补，其末端都连有相同的PCR引物。要求设计的MS-mlPA探针具有甲基化敏感的限制性内切酶HhaⅠ（GCGC）或HpaⅡ（CCGG）的识别位点。将探针和目标序列杂交后，降低反应体系温度，并向其中加入连接酶HhaⅠ。若原样本DNA中含有HhaⅠ识别的非甲基化位点，则非甲基化探针的两个寡核苷酸部分不能连接，而甲基化的探针顺利连接而不被切割。在随后的PCR反应中，只有两个寡核苷酸部分连接后的探针才能被扩增。最后分析扩增片段，确定待研究位点的甲基化情况。见图6。
图6. MS-mlPA原理
Ø 高通量测序
新一代测序仪的飞速发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组（methylome）的研究成为可能。近两年，多个研究小组将传统的甲基化工具（如DNA的亚硫酸氢盐转化）与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。而新一代测序技术的出现，更是让甲基化的直接测定成为可能。
Ø 基于芯片的甲基化图谱分析
就甲基化图谱分析而言，目前流行的分析方法是甲基化芯片。很多公司都提供了这种工具，包括Aglinet、Illumina和Affymetrix等平台。平台不同，过程也各异。Aglinet的甲基化芯片，将基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光（样品用Cy5标记，对照用Cy3标记），然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3比例显示出该区域的甲基化程度。
Aglinet的244,000-element array覆盖了27000多个人CpG岛和甲基化不足区域（UMR）。NimbleGen的Human 2.1M Deluxe Promoter array也覆盖了27000多个CpG岛，还包括了27000多个启动子区域。以上产品都具有100 bp的分辨率。然而这两个平台都不能以单核苷酸的分辨率报告甲基化状态，但是Illumina的Infinium和GoldenGate的甲基化芯片可以做到。
Illumina的Infinium Human Methylation27 Bead Chip芯片覆盖了27,578个CpG位点。利用两个位点特异探针可检测出位点上的甲基化差异。一个探针是为甲基化位点（M磁珠类型）设计的，而另一个是为未甲基化位点（U磁珠类型）设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定确定位点的甲基化水平。见图7。
图7. DNA甲基化芯片检测原理
沪公网安备 31010402003982号
